隨著高效液相色諧的快速發(fā)展，各種新的色譜技術不斷涌現(xiàn)。其中，反相高效液相色譜因其良好的選擇性，應用的范圍不斷擴大，顯示出很好的應用前景。
反相高效液相色譜是化學鍵合相色譜法的一種。化學鍵合相色譜法是由液液色譜法發(fā)展起米的，是為了解決在分離過程中，機械吸附在載體上的固體液的流失問題而發(fā)展出來的一-種新方法。 鍵合相色譜法通過將不同的有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠載體表面的游離羥基上，而生成化學鍵合固定相?；瘜W鍵合周定相對各種極性溶劑都有良好的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。由它制備的色譜主柱效高、使用壽命長、重現(xiàn)性好，兒乎對各種類型的有機化合物都呈現(xiàn)良好的選擇性，并可用于梯度洗脫操作，消除了分配色譜法的缺點。
根據(jù)鍵合固定相和流動相相對極性的強弱，可將鍵合色譜法分為正相鍵合色譜法和反相鍵合色譜法。反相鍵合色譜法即反相高效液相色譜。在正相鍵合色譜法中，鍵合固定相的極性大于流動相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性和強極性化合物。在反相鍵合相色謂法中，鍵合固定相的極性小于流動相的極性，適用于分離非極性、極性或離子型化合物，其應用范圍也比正相鍵合相色譜法更廣泛。
在反相健合相色請法中伸用的是非極性鍵合固定相。它是將全多孔(或薄光)微粒硅膠載體，經(jīng)酸活化處理后與含羥基鏈或苯基的硅烷化試劑反應，生成表面具有烷基或苯基的非極性固定相。如共價結合到載體上的直鏈碳氫化合物正辛基等。
關于反相色譜的分離機理，吸附色譜的作用制認為溶質在固定相上的保留主要是疏水作用，在高效液相色譜中義被稱為疏溶劑作用。根據(jù)疏溶劑理論，當溶質分子進入極性流動相后，即占據(jù)流動相中相應的空間，而排擠一部分溶劑分子。當溶質分子被流動相推動與因定相接觸時，溶質分子的非極性部分或非極性因子會將非極性固定相上附著的溶劑膜排擠開，而直接與非極性同定相上的烷基官能團相結合(吸附)形成締合絡合物，構成單分子吸附層。這種疏溶劑的吸附作用是可逆的，當流動相極性減少時，這種疏溶劑斥力下降，會發(fā)生解締，并將溶質分子解放而被洗脫下米。
反相色譜中疏水性越強的化合物越容易從流動相中擠出去，在色譜柱中滯留時間也長，所以反相色譜法中不同的化合物根據(jù)它們的疏水特性得到分離。反相色譜法適于分離帶有不同疏水基團的化合物，亦即非極性基團的化合物。此外，反相色譜法可用于分離帶有不同極性基團的化合物?？梢酝ㄟ^改變流動相的溶劑及其組成和pH，以影響溶質分子與流動相的相互作用，改變它們的滯留行為。另外，反相色譜中水的流動相中占的比例伸縮性很大，可以從0-100%，從而使反相色譜可用于水溶性、脂溶性化合物的分離。反相色諧法中的固定相是被共價結合到硅膠載體上的直鏈飽和烷烴，其鏈的長短不同，長的是十八烷基，這也是使用得多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水特性隨著碳氫鏈的長度而增加，在反相色譜柱中溶質由于疏水作用而滯留的時間也將隨著碳氫鏈的長度而增加。在一般情況下這意味著用碳氫鏈長的反相色諧柱能得到較好的分辨率，在多數(shù)情況下是依靠反復試驗選擇色譜柱。由丁反相色譜法的固定相是疏水的碳氫化合物，溶質與固定相之間的作用主要是非極性相互作用，或者說疏水相互作用，因此溶劑的強度隨著極性降低而增加。
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